丁酸梭菌对肉鸡钙磷代谢和胫骨指标的影响
摘要：试验通过在基础日粮中添加丁酸梭菌，研究其对肉鸡钙磷代谢和胫骨指标的影响。选择1日龄180只健康AA肉鸡，随机分入３个处理组，每个处理组６个重复，分别为对照组、抗生素组(ATB)和丁酸梭菌组(CB)。对照组饲喂基础日粮，ATB组在基础日粮中添加5mg/kg黄霉素、75mg/kg金霉素和20mg/kg吉他霉素，CB组在基础日粮中添加2.5×１０8CFU/kg丁酸梭菌，试验期42ｄ。结果显示，与对照组相比，①CB组肉鸡血清钙(CA)、磷(P)含量差异不显著(P＞0.05)，21日龄ATB组肉鸡血清钙含量显著提高(P＜0.05)；②21日龄CB组肉鸡胫骨强度显著提高(P＜0.05);42日龄CB组肉鸡胫骨磷含量极显著提高(P＜0.01)；③21日龄CB组肉鸡排泄物中磷含量极显著降低(P＜0.01)，并与ATB组无显著差异；42日龄CB组肉鸡排泄物中钙含量极显著提高(P＜0.01)，排泄物中磷含量显著提高(P＜0.05)。综合上述结果，在AA肉鸡基础日粮中添加2.5×108 CFU/kg丁酸梭菌有利于改善肉鸡的胫骨发育，改善肉鸡对钙、磷的吸收利用，能有效降低21日龄肉鸡钙、磷排泄量，但并未降低42日龄肉鸡排泄物中钙、磷含量。
钙是动物体内最丰富的矿物质，在骨骼矿化、血液凝结、细胞内信号传导和肌肉收缩中起关键作用。动物所需的钙元素99％用于牙齿与骨骼发育，其余分布于细胞和体液中，维持动物体正常的生理功能。磷是动物生长所必需的无机元素，以植酸磷的形式存在于种子以及植物细胞中。植酸磷不易被家禽消化利用而随排泄物排出体外。为了满足家禽生长的需要，需在饲料中添加无机磷，这就加重了环境的磷污染。自然界中细菌、酵母、霉菌均能分泌植酸酶，因此，添加益生菌可能会改善家禽对饲料中磷的利用。在全球禁止使用促生长型抗生素的形势下，研发新型绿色生物饲料添加剂对于肉鸡产业稳定发展至关重要。丁酸梭菌是严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，能够产生乙酸、丁酸、乳酸等小分子代谢物，促进双歧杆菌、乳酸杆菌、粪杆菌等有益菌增殖、生长。与乳酸菌和双歧杆菌相比，丁酸梭菌可形成内生芽孢，能够抵抗更高浓度的胃酸与胆汁及更高的温度，并能在动物肠道内定植发挥益生功能。良好的菌群结构能够促进骨骼生长发育，丁酸梭菌能显著降低断奶仔猪的腹泻率和IL－６、TNF－α等血清促炎细胞因子含量，还能降低肉鸡盲肠大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌等有害菌的数量，提高盲肠乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌的数量，利于肠道菌群的平衡。关于丁酸梭菌对肉鸡钙、磷代谢和胫骨指标影响的研究报道较少。课题组前期研究了丁酸梭菌对肉仔鸡生长性能、血清生化指标的影响，发现日粮添加丁酸梭菌未显著影响肉鸡的生产性能，但添加抗生素或丁酸梭菌提高了21日龄肉仔鸡血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性，且添加抗生素的效果优于丁酸梭菌；添加丁酸梭菌对42日龄肉鸡血清AKP活性的提高效果显著，但添加抗生素使42日龄肉鸡血清AKP活性降低。在前期研究的基础上，本试验进一步研究了丁酸梭菌对肉鸡血清及排泄物中钙、磷含量及胫骨指标的影响，探讨其对肉鸡钙磷代谢的调控作用。
1. 材料与方法
1.1 材料
丁酸梭菌，粉状，活菌数5.0×109CFU/g。
1.2 试验动物及日粮
选择180只体重相近的1日龄健康AA肉鸡，随机分为3组，每组6个重复，每个重复10只鸡。无抗对照组饲喂基础日粮，抗生素组(ATB)在基础日粮中添加5mg/kg黄霉素、75mg/kg金霉素和20mg/kg吉他霉素，丁酸梭菌组(CB)在基础日粮中添加2.5×108 CFU/kg(50mg/kg)丁酸梭菌。基础日粮采用玉米-豆粕型日粮，参考《鸡饲养标准》(NY/T 33-2004)配制，其组成和营养水平见表1。
1.3 饲养管理
试验于中国农业科学院饲料研究所南口试验基地进行。选取1日龄AA肉鸡，采用立体四层笼养，每层笼饲养10只鸡;23h光照，1h黑暗;乳头式饮水器供水，自由采食试验日粮(粉料)。水循环式暖气供热，前3d鸡舍温度维持在33℃，此后每周降低2℃，直到24℃并维持在此温度。肉鸡1日龄接种马立克疫苗，7日龄滴鼻点眼接种新城疫和肾传支二联苗。试验期42d。
1.4 测定指标及方法
1.4.1 血清生化指标的测定
分别于21、42日龄，每重复选取接近平均体重的肉鸡1只，颈静脉采血10ml，静置、分离血清，利用日立7600全自动生化分析仪测定血清钙(CA)、磷(P)含量，测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，测定方法和结果计算按说明书进行。
1.4.2 胫骨指标的测定
肉鸡采血后屠宰，测定胫骨指标。使用Wd-1电子万能试验机(长春非金属材料试验机器厂)测定胫骨断裂强度，并记录其强度值。将测定后的胫骨收集放入干净的塑料袋保存，备测胫骨灰分含量等指标。右侧胫骨高温蒸煮6min后剥离所有软组织，105℃烘干24h脱水后，用纯度为99.5％的乙醚浸泡96h，65℃烘干4h至恒重，粉碎过40目筛，混 匀，550℃马弗炉中灰化24h，称重，计算灰分含量。灰分含量测定参照GB/T 6438-1992的方法，灰分中钙含量的测定采用乙二胺四乙酸(EDTA)直接容量法(GB/T 6436-1992)，灰分中磷含量测定采用钒钼酸铵法(GB/T 6437-1992)。
1.4.3 排泄物中灰分、钙和磷含量测定
排泄物中灰分、钙、磷含量的测定方法同1.4.2。
1.4.4 干物质、蛋白质表观代谢率的测定
采用指示剂(TIO2)法测定表观代谢率，38~42日龄收集排泄物。将其中混有的皮屑、羽毛和饲料用镊子夹出或吹风机吹出，其余全部排泄物收集于采样盒中，并分次、少量喷洒浓度为10％的盐酸溶液，-20℃ 保存。试验结束，将每重复肉鸡4d的排泄物样品混匀，65℃烘干至恒重，至室温下回潮24h后粉碎过40目筛并编号;同时采集饲料样本。排泄物及饲料中粗蛋白质含量利用杜马斯蛋白质测定仪测定，TIO2含量采用分光光度计法测定。
1.5 试验数据统计分析
用EXCEL软件整理数据，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS21.0软件中的独立样本t检验进行数据分析处理。以P＜0.05为差异显著的判断标准，P＜0.01为差异极显著的判断标准。
2 结 果
2.1 日粮添加丁酸梭菌对肉仔鸡血清钙、磷含量的影响
由表2可知，21日龄，与对照组相比，CB组血清钙、磷含量无显著变化(P＞0.05)，ATB组血清钙含量显著提高(P＜0.05)，并且CB组血清钙、磷含量均显著低于ATB组(P＜0.05)。42日龄，与对照组相比，添加抗生素和丁酸梭菌均未显著影响血清钙、磷含量(P＞0.05)。
2.2 日粮添加丁酸梭菌对肉仔鸡胫骨指标的影响
由表3可知，21日龄，与对照组和ATB组相比，CB组肉仔鸡胫骨强度分别提高了22.83％（P＞0.05）、67.49％（P＜0.01），ATB组胫骨强度极显著低于对照组(P＜0.01)；与对照组和ATB组相比，CB组胫骨钙含量无显著差异(P＞０0.05)，但ATB组胫骨钙含量较对照组极显著提高(P＜0.01);各组肉仔鸡胫骨灰分和磷含量均无显著差异(P＞0.05)。42日龄，与对照组相比，ATB组胫骨灰分含量显著降低(P＜0.05)，对照组和CB组胫骨灰分含量差异不显著(P＞0.05)。与对照组和ATB组相比，CB组胫骨磷含量极显著提高(P＜0.01)，分别提高23.98％、22.51％;但各组肉仔鸡胫骨钙含量和胫骨强度均无显著差异(P＞0.05)。
2.3 日粮添加丁酸梭菌对肉仔鸡排泄物中灰分、钙和磷含量的影响
由表4可知，21和42日龄，各组肉仔鸡排泄物中灰分含量均无显著差异(P＞0.05)。21日龄，与对照组相比，CB组排泄物中钙含量降低5.43％(P＜0.05)，对照组和ATB组间无显著差异(P＞0.05);与对照组相比，CB和ATB组排泄物中磷含量分别降低了8.70％(P＜0.01)、10.14％(P＜0.01)，且CB与ATB组间无显著差异(P＞0.05)。42日龄，与对照组相比，CB和ATB组排泄物中钙含量极显著提高(P＜0.01)，且CB组与ATB组间无显著差异(P＞0.05);与对照组相比，CB组肉仔鸡 排泄物中磷含量显著提高(P＜0.05)，ATB组排泄物磷含量较对照组和CB组差异不显著(P＞0.05)。
2.4 日粮添加丁酸梭菌对肉仔鸡营养物质表观代谢率的影响
由表5可知，与对照组相比，CB组磷、钙表观代谢率均无显著差异(P＞0.05);ATB组磷、钙代谢率均极显著提高(P＜0.01)，分别提高16.18％、5.31％;各组肉仔鸡对日粮中干物质和蛋白质的表观代谢率均无显著差异(P＞0.05)，但ATB组营养物质表观代谢率均高于其他处理组。
3 讨 论
血清钙、磷含量能反映日粮中矿物质含量情况。AKP是一种含锌的糖蛋白，主要由成骨细胞和肝脏合成分泌，AKP的活性与骨病和钙、磷的代谢活动密切相关。高活性的AKP能促进骨形成和骨盐沉积，加快机体代谢，促进动物生长发育。ZHANG等研究发现，日粮中添加丁酸梭菌(1×109CFU/kg)极显著提高了空肠黏膜的AKP活性。李卫芬等在日粮中添加枯草芽孢杆菌，肉鸡血清AKP活性提高了63.16％。孙玲玲等研究表明，日粮中添加枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌对雏鹅血清AKP活性影响不显著。徐晨希等研究结果表明，饲喂丁酸梭菌能极显著降低42日龄肉仔鸡血清中AKP活性。由前期试验结果与本试验结果可知，日粮中丁酸梭菌对21日龄肉仔鸡有提高血清AKP活性的作用，对42日龄肉鸡血清AKP活性的提高效果显著，对肉鸡血清钙、磷含量没有显著影响，可能是因为日粮添加丁酸梭菌能提高骨源AKP进入血清中发挥作用，促进血清钙、磷转运至成骨细胞完成骨合成。本试验中CB组肉鸡前期胫骨钙沉积量较对照组有升高的趋势，后期胫骨磷含量较对照组与ATB组极显著提高，这可能印证血清AKP活性的提高能促进血清钙、磷在胫骨中的沉积。ATB组肉鸡前期血清AKP活性及钙、磷含量均高于CB组，说明日粮中单独添加丁酸梭菌对肉鸡生长的改善弱于添加抗生素的效果，而丁酸梭菌的作用可能是前期在肉鸡肠道建立良好的肠道功能结构及丰富的菌群基础。
钙、磷是羟基磷灰石的主要成分，而羟基磷灰石是骨矿基质的主要形式，决定胫骨的抗压强度和硬度，故胫骨中钙、磷的沉积对胫骨发育至关重要。研究发现，来自肠道病原体的抗原可引发整个肠道上皮屏障的炎性级联反应，增强免疫因子NF-κＢ(RANK)受体和肿瘤坏死因子的产生，而RANK是破骨细胞分化和激活的重要信号因子结合位点，导致破骨细胞生成增加，从而破坏骨生成和骨吸收之间的平衡，限制动物骨骼发育。益生菌可能通过改善营养获取、免疫调节或激素调节等来影响其宿主的激素水平，达到调节骨骼重塑的效果。研究表明，肉鸡早期日粮中添加丁酸梭菌，能使大肠杆菌攻毒肉鸡的盲肠中丁酸依然保持较高水平，弱酸性环境可能会促进Ca2+被肠道上皮细胞吸收。本试验结果表明，与无抗对照组相比，42日龄CB组肉鸡胫骨磷含量显著提高，而21日龄CB组肉鸡胫骨磷含量无显著变化;日粮中添加丁酸梭菌显著提高了21日龄肉鸡胫骨强度，对42日龄肉鸡没有显著影响。CB组42日龄肉鸡的胫骨灰分、磷沉积量与胫骨强度均优于ATB组。综上，丁酸梭菌改善胫骨发育的效果在肉仔鸡生长前期效果显著;日粮添加丁酸梭菌对肉鸡胫骨发育的改善效果优于抗生素。其原因可能是丁酸梭菌可以促进有益菌的生长、抑制如大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长，保护肠道的微生态平衡。同时，日粮中添加丁酸梭菌可能通过维持肉仔鸡肠道菌群稳态，降低骨盐运动和破骨细胞增殖，促进肉仔鸡骨骼稳定发育、生长。本试验中，日粮添加丁酸梭菌和抗生素显著降低了21日龄肉鸡排泄物中磷含量，且排泄物中钙含量也有下降的趋势。这说明丁酸梭菌可提高1~21日龄肉鸡钙、磷代谢率，减少钙、磷排放，可能是因为丁酸梭菌与抗生素均能抑制如大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长，提高肉仔鸡前期抗应激能力;而丁酸梭菌主要为肠道营造弱酸环境，为肉鸡前期生长创造良好的肠道生态，进一步加强钙、磷等矿物质的吸利与利用，其代谢率得以提高。21~42日龄丁酸梭菌组肉鸡排泄物中钙、磷含量均显著提高，但日粮添加丁酸梭菌未明显改善42日龄肉鸡干物质、蛋白质和钙、磷表观代谢率。42日龄CB组肉鸡的血清钙、磷含量与胫骨钙、磷含量较对照组显著提高，但 CB组排泄物中钙、磷含量并未减少，在日粮中钙、磷水平一致的情况下，这说明日粮中添加丁酸梭菌可能提高了肉鸡对钙、磷的吸收利用率，导致后期肉鸡日粮中钙、磷供给量大于肉鸡对钙、磷的实际需要量，日粮中未被吸收利用的钙、磷随排泄物排出，导致钙、磷排泄量较对照组升高。不过也可能是因为本试验只测定了表观代谢率，未考虑内源氮、钙和磷排泄的影响所致。后续试验应进一步研究添加丁酸梭菌对营养物质真代谢率的影响。
４ 结 论
本试验结果表明，在AA肉鸡基础日粮中添加2.5×108CFU/kg丁酸梭菌，有利于改善肉鸡的胫骨发育，改善肉鸡对钙、磷的吸收利用，能有效降低21日龄肉鸡钙、磷排泄，但并未降低42日龄肉鸡排泄物中钙、磷含量;日粮单独添加丁酸梭菌并不能完全取代抗生素对肉鸡生长的改善作用，今后可进一步研究丁酸梭菌与其他益生素的复配添加效果。
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